Fraunhofer-Institut für Zelltherapie und Immunologie, Institutsteil Bioanalytik und Bioprozesse
Fraunhofer-Institut für Zelltherapie und Immunologie, Institutsteil Bioanalytik und Bioprozesse

Zellfreie Proteinsynthese

Das Forschungsfeld der zellfreien Proteinsynthese beschäftigt sich mit der Synthese rekombinanter Proteine in verschiedenen zellfreien Systemen. Um Proteine analysieren zu können, müssen diese zunächst in funktionell aktiver Form zur Verfügung gestellt werden. Die Expression von Proteinen in lebenden Zellen, also in vivo, wird vielfach angewendet, führt jedoch nicht immer zum erwünschten Ziel, da sich nicht jedes Protein in Zellkulturen zufriedenstellend synthetisieren lässt. Eine effiziente Alternative zur Expression von Proteinen in lebenden Zellen stellt daher die zellfreie Proteinsynthese dar. Hierbei werden die Inhaltsstoffe der Zelle genutzt, um ein bestimmtes Zielprotein auf schnelle und kostengünstige Weise herzustellen. Die Verwendung von eukaryotischen Zelllysaten bietet den besonderen Vorteil, dass sie die Synthese von Proteinen mit posttranslationalen Modifizierungen (PTMs) erlauben. Ein besonderer Fokus liegt auf der Charakterisierung, Modifizierung und Funktionsuntersuchung zellfrei hergestellter Antikörperformate und Membranproteine. Zellfreie Systeme werden in zeitsparenden hochparallelisierten Verfahren genutzt um Antikörper und Membranproteine zu synthetisieren und diese unmittelbar einer Funktionsanalytik zuzuführen.

Proteinmarkierung & Modifizierung

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Antikörpertechnologien

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Membranproteinsynthese

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  • Herstellung, Optimierung und Klonierung von »ready-to-express« DNA-Templaten für die zellfreie Proteinsynthese
  • RNA-Synthese (Transkription, Analyse und Aufreinigung von mRNA)
  • Zellfreie Synthese und Charakterisierung rekombinanter Antikörperformate
  • Synthese rekombinanter Antikörperformate auf Basis linearer oder zirkulärer DNA-Template in eukaryotischen In-vitro-Transkriptions-Translationssystemen
  • Parallele Herstellung der Antikörperformate in verschiedenen Reaktionsführungen, z.B. im Batch- und Dialyse-Modus bzw. gekoppelt (Transkription und Translation in einem Reaktionssystem) und entkoppelt (Transkription und Translation in separaten Reaktionen)
  • Bestimmung der Syntheseausbeute mittels (14C)-Protein-Labeling und TCA-Präzipitation
  • Charakterisierung der Proteinexpression durch Gelelektrophorese, Autoradiographie und quantitatives Imaging im Phosphorimager
  • Protein-Analyse mittels Fluoreszenz-Mikroskopie und Western Blotting
  • Gerichtete Proteinevolution durch Mutagenese und Aktivitäts-Screening
  • Kotranslationale Markierung von Antikörperfragmenten, z.B. mit Fluoreszenzfarbstoffen
  • Funktionsuntersuchungen an zellfrei hergestellten Antikörperfragmenten z.B. durch ELISA
  • Optimierung von In-vitro-Translationssystemen zur Synthese Disulfid-verbrückter Proteine

Zellkulturlabore der Sicherheitsklasse S1

  • 5 L Fermenter (Sartorius Biostat B DCU-II Advanced Additive Flow System; 2x 5 l Kessel, aufrüstbar mit bis zu 6 Gefäßen zwischen 1 und 10 l)
  • 30 L Fermenter (Sartorius Biostat D DCU)
  • konfokales Laserscanning-Mikroskop (Zeiss CLSM 510)
  • automatisierte Zellassay- und Screening-Einheit (PerkinElmer; CellLuxCellularFluorescence Workstation)
     

Isotopenlabor

  • Proteinmarkierung (Umgang mit 14C, 32P, 35S)
  • Absauganlage für die Abtrennung von 14C-markierten Proteinpräzipitaten (TCA-Präzipitation)
  • Szintillationszähler (Beckmann LS 6500 Multi Purpose Scintillation Counter)
  • Geltrocknungsanlage für Autoradiogramme (Unigeldryer 3545)
  • Typhoon Trio+ variable-mode-Imager (Radioaktivität, Fluoreszenz und Chemilumineszenz mit erweitertem 10 µm Pixel-Scan)
     

Labore der Sicherheitsklasse S1 für molekularbiologische Arbeiten

  • Multimode Reader Berthold LB 941 vi-S TriStar (Flash-, Glow- und Farb-Lumineszenz, Absorption, Fluoreszenz, FRET, BRET)
  • Sirius single tube Luminometer (Titertek Berthold)
  • Spektralphotometer für UV/Vis (Nanodrop ND-2000c)
  • Bioreaktoren für die zellfreie Proteinsynthese im Batchverfahren und im Dialysemaßstab
     

Massenspektrometrie in Laboren der Sicherheitsklasse S1

  • Massenspektrometer Q-TOF MaxIs Impact (Bruker Daltonics) mit austauschbaren Ionenquellen (offline nanoESI source, conventional ESI source, captive spray für die Nano-LC Kopplung)
  • Ultra-sensitive Ionenfalle AmaZon Speed ETD (Bruker Daltonics) mit austauschbaren Ionenquellen (conventional ESI source, captive spray für die Nano-LC Kopplung)
  • UHPLC Chromatographieanlagen, Ultimate 3000 nanoRSLC system (Dionex)
     

Analytik von Membranproteinen in Laboren der Sicherheitsklasse S1

  • Patch-Clamp System »Port-A-Patch« und Orbit 16 der Firma Nanion
  • Partikelanalyse mittels »Zetasizer Nano ZS« der Firma Malvern

  • Jérôme V, Thoring L, Salzig D, Kubick S, Freitag R. Comparison of cell-based versus cell-free mammalian systems for the production of a recombinant human bone morphogenic growth factor. Engineering in Life Sciences 2017 Aug 7. doi:10.1002/elsc.201700005
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  • Quast RB, Ballion B, Stech M, Sonnabend A, Varga BR, Wüstenhagen DA, Kele P, Schiller SM, Kubick S. Cell-free synthesis of functional human epidermal growth factor receptor: Investigation of ligand-independent dimerization in Sf21 microsomal membranes using non-canonical amino acids. Sci Rep. 2016 Sep 27;6:34048. DOI dx.doi.org/10.1038/srep34048 Artikel
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  • Shaklee PM, Semrau S, Malkus M, Kubick S, Dogterom M, Schmidt T. Protein incorporation in giant lipid vesicles under physiological conditions. Chembiochem. 2010 Jan 25;11(2):175-9.
  • Royall E, Woolaway KE, Schacherl J, Kubick S, Belsham GJ, Roberts LO. The Rhopalosiphum padi virus 5' internal ribosome entry site is functional in Spodoptera frugiperda 21 cells and in their cell-free lysates: implications for the baculovirus expression system. J Gen Virol. 2004 Jun;85(Pt 6):1565-9.

Patente

STECH, Marlitt; HANACK, Katja; MESSERSCHMIDT, Katrin; KUBICK, Stefan: METHOD FOR PRODUCING POLYCLONAL ANTIBODIES USING AN ANTIGENIC COMPOSITION COMPRISING PROTEIN-CONTAINING MEMBRANE VESICLES. PCT/EP2014/002592

STECH, MARLITT; QUAST, ROBERT; WUESTENHAGEN, DOREEN; KUBICK, STEFAN: Verfahren und vorrichtung zur zellfreien proteinsynthese in gegenwart eines caspase-inhibitors. PCT/EP2014/002520