Oberflächen für die Zellkultur

Wir entwickeln Beschichtungen aus thermoresponsiven Polymeren für Zellkulturanwendungen mit dem Ziel, Zelladhäsion effektiv und schonend zu kontrollieren. Bei typischen Kultivierungstemperaturen adhärieren und proliferieren die Zellen wie auf einem Standardzellkultursubstrat. Wird die Temperatur um wenige Grad reduziert, lassen sich die Zellen durch einfaches Spülen von diesen Beschichtungen ablösen. Der Verzicht auf invasive Proteasen stellt sicher, dass die Zellvitalität und Membranproteine bei diesem kritischen Prozessschritt nicht beeinträchtigt werden. Die Polymere können homogen oder in definierten Mustern mit einfachen Methoden, wie Spin-Coating, Spray-Coating, Spotting oder Drucken, auf gängigen Zellkultursubstraten kostengünstig aufgetragen werden. Neben dem Einsatz als Zellkultursubstrat eignet sich die Polymerbeschichtung für Zelltests, die eine Untersuchung der Zellmigration erlauben (z.B. Wundheilungstest) oder für die Etablierung von Co-kulturen mit definierten geometrischen Beziehungen.

Thermoresponsive Polymerbeschichtungen zur Steuerung von Zelladhäsion

Thermoresponsiv
© Fraunhofer IZI-BB

Kontrolle der Zelladhäsion auf thermoresponsiven Oberflächen. Bei 37 °C sitzen die Zellen adhärent und ausgebreitet auf den Oberflächen. Bei Absenkung der Oberflächentemperatur auf 25 °C lösen sich die Zellen von ihrem Substrat und können durch einfaches Spülen entfernt werden.

Das Institut entwickelt thermoresponsive Polymerbeschichtungen, auf denen Zellen bei typischen Kultivierungstemperaturen gut adhärieren. Wird die Temperatur um wenige Grad reduziert, lassen sich die Zellen durch einfaches Spülen von diesen Beschichtungen ablösen, ohne dass invasive Enzymcocktails notwendig wären. So ist sichergestellt, dass die Vitalität der Zellen bei diesem oftmals kritischen Prozessschritt nicht beeinträchtigt wird. Die Polymere können homogen oder in definierten Mustern mit einfachen Methoden, wie Spin-Coating, Spotting oder Drucken, auf fast allen gängigen Zellkultursubstraten kostengünstig aufgetragen werden. So lässt sich der Anwendungsbereich der thermoresponsiven Beschichtungen über die schonende Durchführung von Standardprotokollen hinaus beträchtlich ausweiten. So können Co-Kulturen mit definierten geometrischen Beziehungen mit diesem Ansatz einfach hergestellt werden. Tests zeigen, dass sich mit den Polymerbeschichtungen die Handhabung von Zellassays, z.B. für Wundheilung oder Zellmigration, beträchtlich verbessern lässt, wobei zusätzlich Zuverlässigkeit und Präzission zunehmen. Die Etablierung neuartiger Zellassay-Formate stellt einen weiteren Teil der Aktivitäten der Arbeitsgruppe dar.

Thermoresponsive Polymerbeschichtungen
© Fraunhofer IZI-BB

Kontrolle der Zelladhäsion auf strukturierten thermoresponsiven Oberflächen. Thermoresonsive Mikrogele können auf vielen Oberflächen lokal aufgebracht werden (in diesem Fall in kreisrunden Inseln). Bei 37 °C bilden sich homogene Zellen aus (1). Mit Absenkung der Oberflächentemperatur auf 25 °C lösen sich die Zellen selektiv von ihrem Substrat (2 & 3). Wenn die Temperatur wieder erhöht wird, besiedeln die Zellen wieder die thermoresponsiven Bereiche (4).

Durch Erniedrigung der Kultivierungstemperatur von 37 °C auf 28 °C geht ein thermoresponsives Zellkultivierungssubstrat von einem zellattraktiven in einen zellabstoßenden Zustand über. Dies führt zu einer nichtinvasiven Ablösung der Zellen vom Substrat. 

© Video Fraunhofer IZI-BB

Abbildung der Kontaktfläche von Fibroblasten auf einem thermoresponsiven Zellkultivierungssubstrat während der Zellablösung.

© Video Fraunhofer IZI-BB

  • Polyelektrolytschichten (Layer-by-Layer-(LbL)-Auftragung) als Reservoire für Biomoleküle zur Steuerung von adhärenten Zellen, Schichten (Self assembled monolayers (SAM)) aus Polymeren und Biomolekülen zur Verbesserung der Biokompatibilität synthetischer Oberflächen
  • Techniken zur Herstellung homogener und strukturierter Beschichtungen: Spin Coating, Dip Coating, Sprühen, Spotten, Drucken (µ-Contact Printing)
  • Umfangreiches Methodenspektrum zur nichtinvasiven Untersuchung und Charakterisierung von Oberflächen und Beschichtungen: Kontaktwinkel-Bestimmung, Ellipsometrie, Oberflächenplasmonen-Spektroskopie (SPR), fluoreszenzmikroskopische Techniken, Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP), Rasterkraftmikroskopie (AFM)
  • Zeitaufgelöste Untersuchung der Zelladhäsion auf funktionalisierten Oberflächen mittels Totalreflexionsmikroskopie (TIRFM)
  • Charakterisierung mechanischer Eigenschaften von Oberflächen und Beschichtungen mittels Mikroindentation
  • Einlagerung und Kultivierung von eukaryotischen Zellen auf S1-Ebene (Säugertierzellen, Insektenzellen, Primärzellen, Zelllinien)

Geräte

  • Durchlicht- und Auflichtmikroskopie mit Hellfeld-, Phasenkontrast-, Fluoreszenz-, Polarisations- und Totalreflexionseinrichtung (TIRFM), höchstauflösende optische Mikroskopie (SIM), jeweils mit rechnergesteuerten und temperierbaren Objekttischen und Zellkulturkammern ausgerüstet
  • Konfokales Raster-Laser-Mikroskop mit 3D-Bildverarbeitung
  • Vollautomatisierte Fluoreszenzmikroskope für Aufnahmen lebender Zellen unter physiologischen Bedingungen (Time-Lapse-Mikroskopie) (Olympus CellR)
  • TIRF-Mikroskopie (Olympus)
  • Laser Tweezer / optische Pinzette mit Laser-Mikrodissektion (Palm / Zeiss)
  • Rasterkraftmikroskopie für biologische Anwendungen / Bio-AFM (JPK)
  • Variables Mikrofluidik-Setup
  • Multiskop für abbildende Ellipsometrie, Oberflächen-Plasmonenresonanz / SPR (Optrel)
  • Bedampfungsanlage zur Herstellung dünner metallischer Schichten (Edwards)
  • Microcontact Printer (GeSiM)
  • Kontaktwinkelmessgerät
  • Durchflusszytometer (Becton D.)
  • Mikromanipulation, Mikroinjektion, Mikrodissektion (Eppendorf)

  • Uhlig K, Wegener T, He J, Zeiser M, Bookhold J, Dewald I, Godino N, Jaeger MS, Hellweg T, Fery A, Duschl C. Patterned thermoresponsive microgel coatings for noninvasive processing of adherent cells. Biomacromolecules (2016),  17, S. 1110-1116.
  • Velk N, Uhlig K, Duschl C, Volodkin D. Mobility of Lysozyme in Poly(L-lysine)/Hyaluronic Acid Multilayer Films. Colloids Surfaces B (2016), 47, S. 343-350.
  • Vikulina AS, Anissimov YG, Singh P, Prokopović VZ, Uhlig U, Jaeger MS, von Klitzing R, Duschl C, Volodkin D. Temperature effect on build-up of exponentially growing polyelectrolyte multilayers. Exponential-to-linear transition point. Phys. Chem. Chem. Phys. (2016), 18, S. 7866-7874.
  • Prokopovic VZ, Duschl C, Volodkin D. Hyaluronic acid/poly-L-lysine Multilayers as Reservoirs for Storage and Release of Small Charged Molecules. Macromo. Biosci. (2015), 15, S. 1357-1363.
  • Vikulina AS, Aleed ST, Paulraj T, Vladimirov YA, von Klitzing R, Duschl C, Volodkin D. Temperature-induced molecular transport through polymer multilayers coated with pNIPAM microgels. Phys. Chem. Chem. Phys. (2015), 17, S. 12771-12777.
  • Paulraj T, Feoktistova N, Velk N, Uhlig K, Duschl C, Volodkin D. Microporous polymeric 3D scaffolds templated by the Layer-by-Layer self-assembly. Macromol. Rapid Comm. (2014) 35, S. 1408-1413.
  • Schmidt S, Uhlig K, Duschl C, Volodkin D. Stability and Cell Uptake of Calcium Carbonate Templated Insulin Microparticles. Acta Biomat. (2014), 10, S. 1423-1430.
  • Uhlig K, Boerner HG, Wischerhoff E, Lutz JF, Jaeger MS, Laschewsky A, Duschl C. On the interaction of adherent cells with thermoresponsive polymer coatings. Polymers. (2014), 6, 1164-1177.
  • Madaboosi N, Uhlig K, Jäger MS, Möhwald H, Duschl C, Volodkin D. Microfluidics as A Tool to Understand the Build-Up Mechanism of Exponential-Like Growing Films. Macromol Rapid Comm. (2012), 33(20), 1775-1779.
  • Madaboosi N, Uhlig K, Schmidt S, Jaeger MS, Möhwald H, Duschl C, Volodkin D. Microfluidics meets soft layer-by-layer films: selective cell growth in 3D polymer architectures. Lab Chip. (2012), 12, S. 1434-1436.
  • Schmidt S, Behra M, Uhlig K, Madaboosi N, Hartmann L, Duschl C, Volodkin D. Mesoporous Protein Particles through Colloidal CaCO3 Templates. Adv. Funct. Mat. (2012) 23, S. 116-123.
  • Uhlig K, Boysen B, Lankenau A, Jaeger MS, Wischerhoff E, Lutz JF, Laschewsky A, Duschl C. On the influence of the architecture of poly(ethylene glycol)-based thermoresponsive polymers on cell adhesion. Biomicrofluidics (2012), 6, S. 024129.
  • Uhlig K, Madaboosi N, Schmidt S, Jäger MS, Rose J, Duschl C, Volodkin D. 3D localization and diffusion of proteins in polyelectrolyte multilayers. Soft Matter (2012),  8, S. 11786-11789.
  • Volodkin VS, Schmidt S, Fernandes P, Larionova NI, Sukhorukov GB, Duschl C, Möhwald H, von Klitzing R. One-step formulation of protein microparticles with tailored properties: hard templating at soft conditions. Adv. Funct. Mat. (2012), 22, S. 1914-1922.
  • Schmidt S, Zeiser M, Hellweg T, Duschl C, Fery A, Möhwald H. Adhesion and Mechanical Properties of PNIPAM Microgel Films and their Potential Use as Switchable Cell Culture Substrates. Adv. Funct. Mat. (2010), 20, S. 3235-3244.
  • Uhlig K, Wischerhoff E, Lutz JF, Laschewsky A, Jaeger MS, Lankenau A, Duschl C. Monitoring cell detachment on PEG-based thermoresponsive surfaces using TIRF microscopy. Soft Matter. (2010), 6, 4262-4267.
  • Kessel S, Müller R, Schmidt S, Wischerhoff E, Laschewsky A, Lutz JF, Uhlig K, Lankenau A, Duschl C and Fery A. Thermoresponsive, PEG-based Polymer Layers: Surface Characterization with AFM Force Measurements. Langmuir (2009), 26, S. 3462–3467.
  • Ernst O, Lieske A, Holländer A, Lankenau A, Duschl C. Tailoring of Thermo-Responsive Self-Assembled Monolayers for Cell Type Specific Control of Adhesion. Langmuir (2008), 24, S. 10259.
  • Wischerhoff E, Uhlig K, Lankenau A, Börner HG, Laschewsky A, Duschl C, Lutz JF. Controlled Cell Adhesion on PEG-based Switchable Surfaces. Angew. Chem. (2008), 47, S. 5666-5668.
  • Ernst O, Lieske A, Jaeger M, Lankenau A, Duschl C. Control of cell detachment in a microfluidic device using a thermoresponsive copolymer on a gold substrate. Lab Chip. (2007), 7, 1322–1329.

Patente

  • Duschl C, Lankenau A, Lutz J-F, Laschewsky A, Wischerhoff E, Fuhr GR, Bier F. Substrat, Kultivierungseinrichtung und Kultivierungsverfahren für biologische Zellen. DE 10 2010 012 254 A1. 22. Sept. 2011.
  • Duschl C, Hellweg T, Lankenau A, Laschewsky A, Lutz J-F, Schmidt S, Wischerhoff E. Thermoresponsives Substrat mit Mikrogelen, Verfahren zu dessen Herstellung und Kultivierungsverfahren für biologische Zellen. EP 2 550 352 B1. 22. Sept. 2011.

  • GeSiM mbH, Großerkmannsdorf
  • Mikrofluidik ChipShop, Jena
  • BST Bio Sensor Technology GmbH
  • University of Jerusalem, Israel
  • Ecole Polytechnique Federal Suisse, Lausanne, Schweiz
  • Centre Suisse dElectronique et Microtechnique Neuchâtel, Schweiz
  • Universität Bielefeld
  • Nottingham Trent University