Immunfluoreszenzfärbung zur Untersuchung der Proteine, die für die Zelladhäsion relevant sind.

Oberflächen für die Zellkultur

Kontrolle der Zelladhäsion auf thermoresponsiven Oberflächen. Bei 37 °C sind die Zellen adhärent und ausgebreitet auf den Polymeroberflächen. Durch Abkühlen der Oberflächentemperatur auf 25 °C lösen sich die Zellen von ihrem Substrat und können durch einfaches Spülen geerntet werden. Dieser Prozess ist reversibel, d. h. durch erneutes Erwärmen auf 37 °C können die Zellen wieder auf dem Substrat adhärieren.
© Fraunhofer IZI-BB
Kontrolle der Zelladhäsion auf thermoresponsiven Oberflächen. Bei 37 °C sind die Zellen adhärent und ausgebreitet auf den Polymeroberflächen. Durch Abkühlen der Oberflächentemperatur auf 25 °C lösen sich die Zellen von ihrem Substrat und können durch einfaches Spülen geerntet werden. Dieser Prozess ist reversibel, d. h. durch erneutes Erwärmen auf 37 °C können die Zellen wieder auf dem Substrat adhärieren.

Wir entwickeln Beschichtungen aus thermoresponsiven Polymeren für Zellkulturanwendungen mit dem Ziel, Zelladhäsion effektiv und schonend zu kontrollieren. Bei typischen Kultivierungstemperaturen adhärieren und proliferieren die Zellen wie auf einem Standardzellkultursubstrat. Wird die Temperatur um wenige Grad reduziert, lassen sich die Zellen durch einfaches Spülen von diesen Beschichtungen ablösen. Der Verzicht auf invasive Proteasen stellt sicher, dass die Zellvitalität und Membranproteine bei diesem kritischen Prozessschritt nicht beeinträchtigt werden. Die Polymere können homogen oder in definierten Mustern mit einfachen Methoden, wie Spin-Coating, Spray-Coating, Spotting oder Drucken, auf gängigen Zellkultursubstraten kostengünstig aufgetragen werden. Neben dem Einsatz als Zellkultursubstrat eignet sich die Polymerbeschichtung für Zelltests, die eine Untersuchung der Zellmigration erlauben (z.B. Wundheilungstest) oder für die Etablierung von Co-kulturen mit definierten geometrischen Beziehungen.

Zeitrafferaufnahme des Ablösungsprozesses von L929-Mausfibroblasten während des Abkühlens von 37 °C auf Raumtemperatur. Die Zellen wurden auf einer beschichteten Zellkulturschale kultiviert. Die Beschichtung besteht aus einem thermoresponsiven Polymer, das über ein Sprühverfahren aufgebracht wurde. Dauer der Zeitrafferaufnahme: 30 min.

Strukturierte thermoresponsive Oberflächen zur lokalen Steuerung der Zelladhäsion

© Fraunhofer IZI-BB

Thermoresponsive Mikrogele können auf unterschiedlichen Oberflächen mittels Druck- oder Spottingverfahren lokal aufgebracht werden. Bei 37 °C wachsen die Zellen homogen auf der gesamten Oberfläche. Durch Abkühlen der Oberflächentemperatur auf 25 °C lösen sich selektiv Zellen von ihrem Substrat.

Wenn die Temperatur wieder erhöht wird, besiedeln die Zellen erneut die thermoresponsiven Bereiche. Dadurch können Zellmigrationsassays definiert und reproduzierbar z. B. auch in mikrofluidischen Kanälen durchgeführt werden.

PartiSens: Partikelbasierte Substrate für die schonende Expansion hochwertiger Zellproben

Dieses Projekt thematisiert die Kombination aus thermoresponsiven Oberflächen und Microcarrierzellkultur. 1. Die Zellen können schonend und unaufwändig durch Abkühlen geerntet werden. 2. Durch die Vergrößerung der Zellkulturoberfläche wird die Ausbeute erhöht. 3. Durch den Einsatz optischer Sensorpartikeln als Zellkultursubstrat kann die Wachstumsrate bestimmt werden und somit der Prozess kontrolliert werden.

Untersuchung der Zell-Oberflächen-Wechselwirkung

Visualisierung der Kontaktfläche von Fibroblasten auf einem thermoresponsiven Zellkultivierungssubstrat während der Zellablösung, die durch das Abkühlen der Probe an Raumtemperatur ausgelöst wurde. Zeitrafferaufnahme: Dauer 1 h.

  • Polyelektrolytschichten (Layer-by-Layer-(LbL)-Auftragung) als Reservoire für Biomoleküle zur Steuerung von adhärenten Zellen, Schichten (Self assembled monolayers (SAM)) aus Polymeren und Biomolekülen zur Verbesserung der Biokompatibilität synthetischer Oberflächen
  • Techniken zur Herstellung homogener und strukturierter Beschichtungen: Spin Coating, Dip Coating, Sprühen, Spotten, Drucken (µ-Contact Printing)
  • Umfangreiches Methodenspektrum zur nichtinvasiven Untersuchung und Charakterisierung von Oberflächen und Beschichtungen: Kontaktwinkel-Bestimmung, Ellipsometrie, Oberflächenplasmonen-Spektroskopie (SPR), fluoreszenzmikroskopische Techniken, Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP), Rasterkraftmikroskopie (AFM)
  • Zeitaufgelöste Untersuchung der Zelladhäsion auf funktionalisierten Oberflächen mittels Totalreflexionsmikroskopie (TIRFM)
  • Charakterisierung mechanischer Eigenschaften von Oberflächen und Beschichtungen mittels Mikroindentation
  • Einlagerung und Kultivierung von eukaryotischen Zellen auf S1-Ebene (Säugertierzellen, Insektenzellen, Primärzellen, Zelllinien)

Geräte

  • Durchlicht- und Auflichtmikroskopie mit Hellfeld-, Phasenkontrast-, Fluoreszenz-, Polarisations- und Totalreflexionseinrichtung (TIRFM), höchstauflösende optische Mikroskopie (SIM), jeweils mit rechnergesteuerten und temperierbaren Objekttischen und Zellkulturkammern ausgerüstet
  • Konfokales Raster-Laser-Mikroskop mit 3D-Bildverarbeitung
  • Vollautomatisierte Fluoreszenzmikroskope für Aufnahmen lebender Zellen unter physiologischen Bedingungen (Time-Lapse-Mikroskopie) (Olympus CellR)
  • TIRF-Mikroskopie (Olympus)
  • Laser Tweezer / optische Pinzette mit Laser-Mikrodissektion (Palm / Zeiss)
  • Rasterkraftmikroskopie für biologische Anwendungen / Bio-AFM (JPK)
  • Variables Mikrofluidik-Setup
  • Multiskop für abbildende Ellipsometrie, Oberflächen-Plasmonenresonanz / SPR (Optrel)
  • Bedampfungsanlage zur Herstellung dünner metallischer Schichten (Edwards)
  • Microcontact Printer (GeSiM)
  • Kontaktwinkelmessgerät
  • Durchflusszytometer (Becton D.)
  • Mikromanipulation, Mikroinjektion, Mikrodissektion (Eppendorf)

  • Uhlig K, Wegener T, Hertle Y, Bookhold J, Jaeger M, Hellweg T, Fery A, Duschl C. Thermoresponsive Microgel Coatings as Versatile Functional Compounds for Novel Cell Manipulation Tools. Polymers (2018), 10, 656.
  • Madaboosi N, Uhlig K, Schmidt S, Vikulina AS, Möhwald H, Duschl C, Volodkin D. A “Cell-Friendly” Window for the Interaction of Cells with Hyaluronic Acid/Poly-l-Lysine Multilayers. Macromol. Biosci. (2017), 1700319.
  • Uhlig K, Wegener T, He J, Zeiser M, Bookhold J, Dewald I, Godino N, Jaeger MS, Hellweg T, Fery A, Duschl C. Patterned thermoresponsive microgel coatings for noninvasive processing of adherent cells. Biomacromolecules (2016),  17, S. 1110-1116.
  • Velk N, Uhlig K, Duschl C, Volodkin D. Mobility of Lysozyme in Poly(L-lysine)/Hyaluronic Acid Multilayer Films. Colloids Surfaces B (2016), 47, S. 343-350.
  • Vikulina AS, Anissimov YG, Singh P, Prokopović VZ, Uhlig U, Jaeger MS, von Klitzing R, Duschl C, Volodkin D. Temperature effect on build-up of exponentially growing polyelectrolyte multilayers. Exponential-to-linear transition point. Phys. Chem. Chem. Phys. (2016), 18, S. 7866-7874.
  • Prokopovic VZ, Duschl C, Volodkin D. Hyaluronic acid/poly-L-lysine Multilayers as Reservoirs for Storage and Release of Small Charged Molecules. Macromo. Biosci. (2015), 15, S. 1357-1363.
  • Vikulina AS, Aleed ST, Paulraj T, Vladimirov YA, von Klitzing R, Duschl C, Volodkin D. Temperature-induced molecular transport through polymer multilayers coated with pNIPAM microgels. Phys. Chem. Chem. Phys. (2015), 17, S. 12771-12777.
  • Paulraj T, Feoktistova N, Velk N, Uhlig K, Duschl C, Volodkin D. Microporous polymeric 3D scaffolds templated by the Layer-by-Layer self-assembly. Macromol. Rapid Comm. (2014) 35, S. 1408-1413.
  • Schmidt S, Uhlig K, Duschl C, Volodkin D. Stability and Cell Uptake of Calcium Carbonate Templated Insulin Microparticles. Acta Biomat. (2014), 10, S. 1423-1430.
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  • Madaboosi N, Uhlig K, Jäger MS, Möhwald H, Duschl C, Volodkin D. Microfluidics as A Tool to Understand the Build-Up Mechanism of Exponential-Like Growing Films. Macromol Rapid Comm. (2012), 33(20), 1775-1779.
  • Madaboosi N, Uhlig K, Schmidt S, Jaeger MS, Möhwald H, Duschl C, Volodkin D. Microfluidics meets soft layer-by-layer films: selective cell growth in 3D polymer architectures. Lab Chip. (2012), 12, S. 1434-1436.
  • Schmidt S, Behra M, Uhlig K, Madaboosi N, Hartmann L, Duschl C, Volodkin D. Mesoporous Protein Particles through Colloidal CaCO3 Templates. Adv. Funct. Mat. (2012) 23, S. 116-123.
  • Uhlig K, Boysen B, Lankenau A, Jaeger MS, Wischerhoff E, Lutz JF, Laschewsky A, Duschl C. On the influence of the architecture of poly(ethylene glycol)-based thermoresponsive polymers on cell adhesion. Biomicrofluidics (2012), 6, S. 024129.
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  • Volodkin VS, Schmidt S, Fernandes P, Larionova NI, Sukhorukov GB, Duschl C, Möhwald H, von Klitzing R. One-step formulation of protein microparticles with tailored properties: hard templating at soft conditions. Adv. Funct. Mat. (2012), 22, S. 1914-1922.
  • Schmidt S, Zeiser M, Hellweg T, Duschl C, Fery A, Möhwald H. Adhesion and Mechanical Properties of PNIPAM Microgel Films and their Potential Use as Switchable Cell Culture Substrates. Adv. Funct. Mat. (2010), 20, S. 3235-3244.
  • Uhlig K, Wischerhoff E, Lutz JF, Laschewsky A, Jaeger MS, Lankenau A, Duschl C. Monitoring cell detachment on PEG-based thermoresponsive surfaces using TIRF microscopy. Soft Matter. (2010), 6, 4262-4267.
  • Kessel S, Müller R, Schmidt S, Wischerhoff E, Laschewsky A, Lutz JF, Uhlig K, Lankenau A, Duschl C and Fery A. Thermoresponsive, PEG-based Polymer Layers: Surface Characterization with AFM Force Measurements. Langmuir (2009), 26, S. 3462–3467.
  • Ernst O, Lieske A, Holländer A, Lankenau A, Duschl C. Tailoring of Thermo-Responsive Self-Assembled Monolayers for Cell Type Specific Control of Adhesion. Langmuir (2008), 24, S. 10259.
  • Wischerhoff E, Uhlig K, Lankenau A, Börner HG, Laschewsky A, Duschl C, Lutz JF. Controlled Cell Adhesion on PEG-based Switchable Surfaces. Angew. Chem. (2008), 47, S. 5666-5668.
  • Ernst O, Lieske A, Jaeger M, Lankenau A, Duschl C. Control of cell detachment in a microfluidic device using a thermoresponsive copolymer on a gold substrate. Lab Chip. (2007), 7, 1322–1329.

 

Patente

  • Duschl C, Lankenau A, Lutz J-F, Laschewsky A, Wischerhoff E, Fuhr GR, Bier F. Substrat, Kultivierungseinrichtung und Kultivierungsverfahren für biologische Zellen. DE 10 2010 012 254 A1. 22. Sept. 2011.
  • Duschl C, Hellweg T, Lankenau A, Laschewsky A, Lutz J-F, Schmidt S, Wischerhoff E. Thermoresponsives Substrat mit Mikrogelen, Verfahren zu dessen Herstellung und Kultivierungsverfahren für biologische Zellen. EP 2 550 352 B1. 22. Sept. 2011.

  • Fraunhofer-Institut für Angewandte Polymerforschung, Potsdam
  • Universität Bielefeld, Bielefeld
  • Surflay Nanotec GmbH, Berlin
  • Ibidi GmbH, München
  • GeSiM mbH, Großerkmannsdorf