Eukaryotische Lysate
© Fraunhofer IZI-BB

Evaluierung der Proteinsynthese in zellfreien Systemen - Proteinexpressionsservice

Die Evaluierung der Proteinsynthese stellt eine interessante F&E Diensleistung für industrielle Forschungsprojekte dar. Die zellfreie Proteinsynthese, häufig auch als in vitro Translation bezeichnet, ist eine schnell und effizient durchführbare Technik, die im Vergleich zu in vivo Methoden mit deutlich weniger Arbeitsschritten zum Ziel führt. Mit dieser Methode können Proteine direkt mit Hilfe von Lysaten, welche aus kultivierten Zelllinien stammen, in ihrer natürlichen Umgebung synthetisiert werden. Diverse zellfreie Systeme, auf der Basis von Lysaten aus pro- und eukaryotischen Resourcen, ermöglichen die Herstellung eines breiten Spektrums unterschiedlich strukturierter und modifizierter Proteine. Im Verlauf des Projektes werden verschiedene zellfreie Systeme untersucht um je nach Fragestellung das passende System zu finden. Hierbei werden besondere Anforderungen, wie Glykosylierung, Membranproteinsynthese in nativer Umgebung, Disulfidverbrückung oder auch Signalsequenzabpaltungen addresiert.

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Die Evaluierung kann in mehrere Phasen aufgeteilt werden. Während der Phase I wird eine erste Bewertung der Synthese des Zielproteins durchgeführt. In dieser Phase können verschiedene Lysate eingesetzt werden, um das optimale System für die Expression eines bestimmten Zielproteins zu etablieren (basierend auf kultivierten Insekten-, CHO- oder humanen Zelllinien, E. coli und Weizenkeimlysaten). Als Template können Plasmide oder mRNA verwendet werden. Das Testen von bereits vorhandenen Templaten oder das Design und die Generierung von optimalen Templaten wird für die verschiedenen Systeme realisiert. Die Einführung von Mutationen z.B. für das Protein-Engineering ist ebenfalls möglich. 

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Eine weitere Optimierung der Reaktionsbedingungen in definierten Systemen wird in Phase II durchgeführt, um die Ausbeute und/oder Aktivität der neu zu synthetisierenden Proteine zu verbessern. Eine Aufreinigung des Zielproteins, die Durchführung von Aktivitätsassays (z.B. ELISAs), eine elektrophysiologische Charakterisierung von Membranproteinen (z.B. Ionenkanäle) aber auch Zellkulturassays (z.B. für Aktivitätsstudien) können in diese Evaluierungsphase einbezogen werden. 

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Nach erfolgreicher Evaluierung der Proteinsynthesebedingungen kann das Zielprotein anschließend in der Phase III im µg- bis mg-Maßstab synthetisiert werden und für weitere Applikationen zur Verfügung gestellt werden. 

Neben der Evaluierung der eigentlichen Proteinsynthese können auch Template, wie mRNA oder DNA validiert und der Einfluss der Sequenzen, aber auch die Qualität der Template auf die Proteinsyntheseleistung untersucht werden. Durch die Möglichkeit der individuellen Einstellung der Synthesebedingungen ergeben sich eine Vielzahl von Anwendungen (s. Bühnenbild). 

Leistungsangebot:

  • Evaluierung der Proteinsynthese unter Verwendung verschiedener zellfreier Systeme (Lysate aus Insektenzellen, CHO-Zellen, kultivierte humane Zellen; E. coli und Weizenkeimlysate) im Batch und im Dialyse-Modus (CECF)
  • Integrierung von regulatorischen Sequenzen, Signalpeptiden, IRES-Sites, Aufreinigungs- und Fluoreszenz-Tags
  • Validierung von DNA und mRNA-Templaten
  • Proteinengineering
  • Bestimmung der Syntheseausbeute mittels (14C)-Protein-Labeling und TCA-Präzipitation
  • Charakterisierung der Proteinsynthese durch Gelelektrophorese, Autoradiographie und quantitatives Imaging im Phosphorimager Protein-Analyse mittels Fluoreszenz-Mikroskopie und Western Blotting
  • Durchführung von Aktivitätsassays direkt im Anschluß an die zellfreise Synthese
  • Herstellung von translationsaktiven Lysaten und deren Integrierung in zellfreie Systeme
  • Bei Interesse kann die zellfreie Synthese von Proteinen standardisiert nach GLP-Richtlinien durchgeführt werden.