Fermentation eukaryotischer Zellen

Die Basis für die zellfreie Proteinsynthese stellen eukaryotische Zelllysate dar. Um diese in translationsaktiver Form zu erhalten, werden definierte Zelllinien unter geeigneten Bedingungen kultiviert. Durch optimale Wachstumsbedingungen der Zelllinien als Suspensionskultur in chemisch definierten Medien in Fermentern und standardisierten Herstellungsprotokollen, wird eine gleichbleibende Qualität der Lysate für die zellfreie Synthese von Proteinen sichergestellt. Für die Fermentation der Zelllinien können verschiedene Reaktionsführungen (Batch, Repeated Batch oder die kontinuierliche Reaktionsführung (Perfusion)), angepasst an die Zelllinie, durchgeführt werden.

Methoden

• Fermentation von eukaryotischen Zelllinien in Suspensionskultur
• Herstellung von translationsaktiven Lysaten und deren Integrierung in zellfreie Systeme
• Entwicklung eukaryotischer zellfreier Translationssysteme
• Test neuer Zelllinien auf ihre In-vitro-Expressionsfähigkeit
• Validierung von DNA und mRNA-Templaten
• Integrierung von regulatorischen Sequenzen, Signalpeptiden, IRES-Sites, Aufreinigungs- und Fluoreszenz-Tags über die Generierung von linearen Templaten
• Zellfreie Synthese von schwer zu exprimierenden Proteinen, wie zytotoxische Proteine und Membranproteine
• Evaluierung der Proteinsynthese unter Verwendung verschiedener zellfreier Systeme (Lysate aus Insektenzellen, CHO-Zellen, kultivierte humane Zellen; E. coli und Weizenkeimlysate) im Batch und im Dialyse-Modus (CECF)
• Bestimmung der Syntheseausbeute mittels (14C)-Protein-Labeling und TCA-Präzipitation
• Charakterisierung der Proteinsynthese durch Gelelektrophorese, Autoradiographie und quantitatives Imaging im Phosphorimager Protein-Analyse mittels Fluoreszenz-Mikroskopie und Western Blotting