Fraunhofer-Institut für Zelltherapie und Immunologie, Institutsteil Bioanalytik und Bioprozesse IZI-BB
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Proteinsynthese

Zellfreie und zellbasierte Bioproduktion
© Fraunhofer IZI-BB
Zellfreie und zellbasierte Bioproduktion

Die Produktion von rekombinanten Proteinen stellt eines der Kernthemen der heutigen Biotechnologie und der pharmazeutischen Industrie dar. Jedes Protein benötigt individuell adaptierte Produktionsprozesse, um neben höchster Qualität auch eine maximale Ausbeute gewährleisten zu können. Unser Institut verfügt über langjährige Expertise in der Produktion rekombinanter Proteine und der zugehörigen Prozessoptimierung. Neben der konventionellen, zellbasierten Produktion liegt unsere Spezialisierung vor allem in der zellfreien Proteinsynthese. Diese Methode ermöglicht nicht nur eine schnellere Produktionszeit und macht den Syntheseprozess  ökonomisch, der Prozess wird auch flexibler und besser steuerbar. Außerdem ermöglicht diese Technologie die Produktion von sonst schwer herstellbaren Proteinen, wie Membranproteinen oder zytotoxisch wirkenden Proteinen.

Schüttler im Labor
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Möglichkeiten für zellbasierte Produktionsprozesse am Fraunhofer IZI-BB. Diverse Möglichkeiten der Kultivierung von eukaryotischen Zellen von Schüttelkolben bis Benchtop (1 l und 5 l) (Bühnenbild - Pilotscale 30l) Fermentationsprozessen. Die Auswahl der Kultivierungsart wird an die jeweilige Anwendung und Entwicklung angepasst.
Proteinsynthese
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Entwicklung und Evaluierung von Proteinproduktionsprozessen angepasst an die individuellen Bedingungen eines erwünschten Zielproteins. Am Fraunhofer IZI-BB sind neben konventionellen, zellbasierten Proteinproduktionssystemen (linker Teil der Abbildung) spezialisierte zellfreie Proteinsyntheseplattformen (rechter Teil der Abbildung) vorhanden, die eine schnelle und parallelisierte Synthese von Proteinen ermöglichen. Die Auswahl der Methode erfolgt abhängig von der zukünftigen Anwendung und den Charakteristiken der Proteine.

Leistungsangebote:

  • »in vivo« versus »in vitro« (zellbasiert versus zellfrei): Vergleiche von Gensequenzen, Promotersequenzen, Signalpeptiden und Reinheitsmarkern für eine Verbesserung und Beschleunigung von industriellen Produktionspipelines
     

Zellbasierte Synthese

  • Nutzung von eukaryotischen Zelllinien (CHO,humane Zelllinien, Sf21) zur rekombinanten Proteinproduktion
  • Evaluation verwendeter Transfektionsmethoden zum Erhalt von hohen Expressionsraten von Zielproteine
  • Entwicklung stabiler Zelllinien für gewünschte Prozesse mittels verschiedener Klonselektions- und Genintegrationsmethoden (z.B. CRISPR Cas)
  • Hochskalierung von Fermentationsprozessen für die rekombinante Proteinproduktion bis zum Pilotmaßstab
     

Zellfreie Synthese

  • Zellfreie Synthese von Membranproteinen und toxischen Proteinen
    • Nanodisks zur Einbettung von Membranproteinen
    • Schnelle, funktionelle Analyse von Ionenkanälen, Transporterproteinen und porenbildenen, toxischen Proteine direkt nach der Synthese  durch elektrophysiologische Methoden in planaren Doppellipidschichten 
  • Maßgeschneiderte Zellfrei-Systeme für kundenspezifische Anwendungen
  • Prokaryotische zellfreie Systeme basierend auf E.coli - Lysaten
  • Eukaryotische zellfreie Systeme basierend auf CHO, Sf21 und K562 Zelllysaten
  • Hochskalierung der Zellfreisysteme für die Produktion und Aufreinigung von medizinisch relevanten Proteinen
  • Entwicklung neuer HTS-Methoden und HTS-kompatibler Systeme für Screening-Anwendungen
  • Kundenspezifische Anpassung von Zelllinien für maßgeschneiderte Zellfrei-Systeme

Anwendungen

Anwendungen der Proteinsynthese
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  • Herstellung, Optimierung und Klonierung von »ready-to-express« DNA-Templaten für die zellfreie Proteinsynthese
  • RNA-Synthese (Transkription, Analyse und Aufreinigung von mRNA)
  • Zellfreie Synthese und Charakterisierung rekombinanter Antikörperformate
  • Synthese rekombinanter Antikörperformate auf Basis linearer oder zirkulärer DNA-Template in eukaryotischen In-vitro-Transkriptions-Translationssystemen
  • Parallele Herstellung der Antikörperformate in verschiedenen Reaktionsführungen, z.B. im Batch- und Dialyse-Modus bzw. gekoppelt (Transkription und Translation in einem Reaktionssystem) und entkoppelt (Transkription und Translation in separaten Reaktionen)
  • Bestimmung der Syntheseausbeute mittels (14C)-Protein-Labeling und TCA-Präzipitation
  • Charakterisierung der Proteinexpression durch Gelelektrophorese, Autoradiographie und quantitatives Imaging im Phosphorimager
  • Protein-Analyse mittels Fluoreszenz-Mikroskopie und Western Blotting
  • Gerichtete Proteinevolution durch Mutagenese und Aktivitäts-Screening
  • Kotranslationale Markierung von Antikörperfragmenten, z.B. mit Fluoreszenzfarbstoffen
  • Funktionsuntersuchungen an zellfrei hergestellten Antikörperfragmenten z.B. durch ELISA
  • Optimierung von In-vitro-Translationssystemen zur Synthese Disulfid-verbrückter Proteine

Zellkulturlabore der Sicherheitsklasse S1

  • 5 L Fermenter (Sartorius Biostat B DCU-II Advanced Additive Flow System; 2x 5 l Kessel, aufrüstbar mit bis zu 6 Gefäßen zwischen 1 und 10 l)
  • 30 L Fermenter (Sartorius Biostat D DCU)
  • konfokales Laserscanning-Mikroskop (Zeiss CLSM 510)
  • automatisierte Zellassay- und Screening-Einheit (PerkinElmer; CellLuxCellularFluorescence Workstation)
     

Isotopenlabor

  • Proteinmarkierung (Umgang mit 14C, 32P, 35S)
  • Absauganlage für die Abtrennung von 14C-markierten Proteinpräzipitaten (TCA-Präzipitation)
  • Szintillationszähler (Beckmann LS 6500 Multi Purpose Scintillation Counter)
  • Geltrocknungsanlage für Autoradiogramme (Unigeldryer 3545)
  • Typhoon Trio+ variable-mode-Imager (Radioaktivität, Fluoreszenz und Chemilumineszenz mit erweitertem 10 µm Pixel-Scan)
     

Labore der Sicherheitsklasse S1 für molekularbiologische Arbeiten

  • Multimode Reader Berthold LB 941 vi-S TriStar (Flash-, Glow- und Farb-Lumineszenz, Absorption, Fluoreszenz, FRET, BRET)
  • Sirius single tube Luminometer (Titertek Berthold)
  • Spektralphotometer für UV/Vis (Nanodrop ND-2000c)
  • Bioreaktoren für die zellfreie Proteinsynthese im Batchverfahren und im Dialysemaßstab
     

Massenspektrometrie in Laboren der Sicherheitsklasse S1

  • Massenspektrometer Q-TOF MaxIs Impact (Bruker Daltonics) mit austauschbaren Ionenquellen (offline nanoESI source, conventional ESI source, captive spray für die Nano-LC Kopplung)
  • Ultra-sensitive Ionenfalle AmaZon Speed ETD (Bruker Daltonics) mit austauschbaren Ionenquellen (conventional ESI source, captive spray für die Nano-LC Kopplung)
  • UHPLC Chromatographieanlagen, Ultimate 3000 nanoRSLC system (Dionex)
     

Analytik von Membranproteinen in Laboren der Sicherheitsklasse S1

  • Patch-Clamp System »Port-A-Patch« und Orbit 16 der Firma Nanion
  • Partikelanalyse mittels »Zetasizer Nano ZS« der Firma Malvern

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Patente

STECH, Marlitt; HANACK, Katja; MESSERSCHMIDT, Katrin; KUBICK, Stefan: METHOD FOR PRODUCING POLYCLONAL ANTIBODIES USING AN ANTIGENIC COMPOSITION COMPRISING PROTEIN-CONTAINING MEMBRANE VESICLES. PCT/EP2014/002592

STECH, MARLITT; QUAST, ROBERT; WUESTENHAGEN, DOREEN; KUBICK, STEFAN: Verfahren und vorrichtung zur zellfreien proteinsynthese in gegenwart eines caspase-inhibitors. PCT/EP2014/002520